人畸胎癌細(xì)胞的培養(yǎng)方法

一．細(xì)胞介紹
細(xì)胞名稱：nccit人畸胎癌細(xì)胞（str鑒定）
1985年shinichiteshima（日本東京，國立癌癥研究所）從一個(gè)縱膈混合型生殖細(xì)胞腫瘤中建立了nccit細(xì)胞系。這株多能性干細(xì)胞可以分化成體細(xì)胞和胚外組織。未分化細(xì)胞介于精原細(xì)胞癌和胚胎癌之間。在維甲酸作用下分化。角蛋白陰性。波形蛋白及胎盤堿性磷酸酶陽性。
二．細(xì)胞特性
1）來源：疾?。憾嗄苄耘咛グ换グ?br>2）形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長
3）含量：>1x106細(xì)胞數(shù)
4）規(guī)格：t25瓶或者1ml凍存管包裝
5)用途：僅供科研使用。
三．運(yùn)輸和保存
干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞
（1）1ml凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。
（2）t25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。
四．細(xì)胞接收后的處理
1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將t25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。
2）請(qǐng)?jiān)?或5x顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。
3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8ml，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。
4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后第一次傳代建議t25培養(yǎng)瓶1：2傳代。
五．細(xì)胞的培養(yǎng)
培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備1640(含nahco31.5g/l,添加nahco31.5g/l,或者atcc-formulatedrpmi-1640medium,catalogno.30-2001atcc改良）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗1%
2）該細(xì)胞在1640(含1.5g/lnahco3)培養(yǎng)基中生長良好，大部分品牌的1640含有較高濃度的nahco3（3.7g/l），若使用1640（3.7g/lnahco3）培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要提高co2濃度（7%-10%）。
3）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
4）凍存液：90%fbs，10%dmso，現(xiàn)用現(xiàn)配。
六．細(xì)胞處理：
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1ml細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6ml完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000rpm條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
貼壁細(xì)胞傳代方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的pbs潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mmedta于培養(yǎng)瓶中（t25瓶1-2ml，t75瓶2-3ml），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%fbs的培養(yǎng)基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000rpm條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新t25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。