SILAC-IP免疫共沉淀實驗

silac-ip免疫共沉淀實驗原理
在分離純化誘餌蛋白-互作蛋白復合物過程中，不可避免地會出現(xiàn)非特異結合蛋白，這些蛋白會一并被質(zhì)譜鑒定出來，成為假陽性的互作蛋白，影響后續(xù)挑選驗證。 傳統(tǒng)的判斷假陽性互作蛋白方法是：用誘餌蛋白組鑒定到的蛋白列表，扣除掉對照組鑒定到的蛋白列表，作為“互作蛋白”。但很多真實的互作蛋白，比如豐度比較高的蛋白，在對照組中也會出現(xiàn)，而傳統(tǒng)的方法就會被排除掉。
silac技術是先將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素，即重鏈、輕鏈氨基酸蛋白。復合物分離后，混在同一管中做酶切質(zhì)譜等。這樣既能鑒定到復合物蛋白，又能根據(jù)同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量，從而更準確地判斷出互作蛋白。
添加技術員溝通實驗
silac-ip實驗技術方案
不同的實驗背景和目的需對應用不同方案，輝駿生物提供以下三種silac-ip實驗方案：
方案一：以野生型細胞株為實驗材料
1．分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)細胞，取等量標記好的細胞提取蛋白質(zhì)；
2．提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白分別用normal igg和抗bait蛋白的特異抗體做co-ip；
3．混合輕、重鏈co-ip產(chǎn)物；
4．胰酶酶切，lc-ms/ms鑒定和定量蛋白。
silac免疫共沉淀技術服務_silac-ip_silac ip實驗外包公司.jpg
方案二：以過表達誘餌蛋白的細胞株為實驗材料
1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)正常對照細胞和過表達誘餌蛋白的細胞株(帶標簽)，取等量標記好的細胞分別提取蛋白質(zhì)，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用誘餌蛋白抗體做co-ip；
3. 收集co-ip后的蛋白液，胰酶酶切，lc-ms/ms鑒定和定量蛋白。
silac ip代做_silac ip外包平臺.jpg
方案三：以干擾誘餌蛋白的細胞株為實驗材料
1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養(yǎng)rnai 誘餌蛋白的細胞株和正常對照細胞株，取等量標記好的細胞分別提取蛋白質(zhì)，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用誘餌蛋白抗體做co-ip；
3. 收集co-ip后的蛋白液，胰酶酶切，lc-ms/ms鑒定和定量蛋白。
silac-ip外包實驗，silac ip技術服務，silac ip檢測實驗.jpg
應用領域
應用背景
用silac結合免疫共沉淀（coip）尋找相互作用蛋白是silac在定量蛋白質(zhì)組學研究基礎上的進一步應用，稱之為silac-ip技術。該技術通過質(zhì)譜鑒定和分析蛋白質(zhì)相對量來判斷是否是特異性結合誘餌蛋白，當實驗組與對照組中某個蛋白質(zhì)量含量達到統(tǒng)計學的差異時，就判定這個蛋白質(zhì)與誘餌蛋白質(zhì)具有相互作用。
傳統(tǒng)方法在判斷假陽性互作蛋白時，很容易將一些在實驗組和對照組中同時出現(xiàn)的真實互作蛋白當做假陽性互作蛋白排除掉，silac-ip技術將實驗組和對照組的蛋白帶上不同的同位素，結合質(zhì)譜分析，既能鑒定到復合物蛋白，又能根據(jù)同位素峰強度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量，從而更準確地判斷出互作蛋白。
相較于傳統(tǒng)的免疫共沉淀和pull down技術，silac-ip技術特異性強，假陽性極低，通量高，靈敏度高，能直接檢測出與bait蛋白互作的其他蛋白的相對含量；適合于可傳代細胞，尤其是易轉基因細胞。