SILAC-IP免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

silac-ip免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)原理
在分離純化誘餌蛋白-互作蛋白復(fù)合物過程中，不可避免地會出現(xiàn)非特異結(jié)合蛋白，這些蛋白會一并被質(zhì)譜鑒定出來，成為假陽性的互作蛋白，影響后續(xù)挑選驗(yàn)證。 傳統(tǒng)的判斷假陽性互作蛋白方法是：用誘餌蛋白組鑒定到的蛋白列表，扣除掉對照組鑒定到的蛋白列表，作為“互作蛋白”。但很多真實(shí)的互作蛋白，比如豐度比較高的蛋白，在對照組中也會出現(xiàn)，而傳統(tǒng)的方法就會被排除掉。
silac技術(shù)是先將實(shí)驗(yàn)組和對照組的蛋白帶上不同的同位素，即重鏈、輕鏈氨基酸蛋白。復(fù)合物分離后，混在同一管中做酶切質(zhì)譜等。這樣既能鑒定到復(fù)合物蛋白，又能根據(jù)同位素峰強(qiáng)度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量，從而更準(zhǔn)確地判斷出互作蛋白。
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silac-ip實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案
不同的實(shí)驗(yàn)背景和目的需對應(yīng)用不同方案，輝駿生物提供以下三種silac-ip實(shí)驗(yàn)方案：
方案一：以野生型細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料
1．分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)細(xì)胞，取等量標(biāo)記好的細(xì)胞提取蛋白質(zhì)；
2．提取的輕鏈、重鏈細(xì)胞總蛋白分別用normal igg和抗bait蛋白的特異抗體做co-ip；
3．混合輕、重鏈co-ip產(chǎn)物；
4．胰酶酶切，lc-ms/ms鑒定和定量蛋白。
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方案二：以過表達(dá)誘餌蛋白的細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料
1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)正常對照細(xì)胞和過表達(dá)誘餌蛋白的細(xì)胞株(帶標(biāo)簽)，取等量標(biāo)記好的細(xì)胞分別提取蛋白質(zhì)，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用誘餌蛋白抗體做co-ip；
3. 收集co-ip后的蛋白液，胰酶酶切，lc-ms/ms鑒定和定量蛋白。
silac ip代做_silac ip外包平臺.jpg
方案三：以干擾誘餌蛋白的細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料
1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養(yǎng)rnai 誘餌蛋白的細(xì)胞株和正常對照細(xì)胞株，取等量標(biāo)記好的細(xì)胞分別提取蛋白質(zhì)，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用誘餌蛋白抗體做co-ip；
3. 收集co-ip后的蛋白液，胰酶酶切，lc-ms/ms鑒定和定量蛋白。
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應(yīng)用領(lǐng)域
應(yīng)用背景
用silac結(jié)合免疫共沉淀（coip）尋找相互作用蛋白是silac在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究基礎(chǔ)上的進(jìn)一步應(yīng)用，稱之為silac-ip技術(shù)。該技術(shù)通過質(zhì)譜鑒定和分析蛋白質(zhì)相對量來判斷是否是特異性結(jié)合誘餌蛋白，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組與對照組中某個蛋白質(zhì)量含量達(dá)到統(tǒng)計學(xué)的差異時，就判定這個蛋白質(zhì)與誘餌蛋白質(zhì)具有相互作用。
傳統(tǒng)方法在判斷假陽性互作蛋白時，很容易將一些在實(shí)驗(yàn)組和對照組中同時出現(xiàn)的真實(shí)互作蛋白當(dāng)做假陽性互作蛋白排除掉，silac-ip技術(shù)將實(shí)驗(yàn)組和對照組的蛋白帶上不同的同位素，結(jié)合質(zhì)譜分析，既能鑒定到復(fù)合物蛋白，又能根據(jù)同位素峰強(qiáng)度判斷誘餌蛋白組和對照組中蛋白的相對含量，從而更準(zhǔn)確地判斷出互作蛋白。
相較于傳統(tǒng)的免疫共沉淀和pull down技術(shù)，silac-ip技術(shù)特異性強(qiáng)，假陽性極低，通量高，靈敏度高，能直接檢測出與bait蛋白互作的其他蛋白的相對含量；適合于可傳代細(xì)胞，尤其是易轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。